Yth. Peserta ZOA-BIOTEK-2001,

Berikut ini kami sampaikan bagian ke-2 dari dua kali posting, makalah 
dari Dr. Arief Witarto.

Moderator

Dedy H.B. Wicaksono

====================================================

4. Random mutation dalam PE

Seperti diutarakan di atas, telah banyak hasil yang dicapai oleh 
PE dengan pendekatan yang rasional berbekal pengetahuan detil terhadap 
struktur 3D protein. Christian B. Anfinsen lebih dari 40 tahun yang 
lalu telah memprediksikan bahwa "kode" struktur protein tersimpan 
dalam sekuen asam aminonya, yang atas jasanya itu mendapat hadiah 
Nobel Kimia tahun 1972. Namun sampai sekarang kita belum mengetahui 
secara persis bagaimana proses terbentuknya struktur protein (secara 
khusus, istilahnya disebut folding problem) dimana hal ini terus 
menjadi tantangan studi dengan simulasi komputer sampai misalnya 
IBM tak segan mengembangkan proyek bernama Blue Gene dengan dana 
100 juta USD khusus untuk memecahkan masalah ini (12). Keterbatasan 
pengetahuan kita terhadap hubungan struktur-fungsi protein menyebabkan 
tak selalu usaha PE berakhir sesuai dengan hasil yang diharapkan.
Kadang satu strategi cocok untuk protein tertentu, namun tidak untuk 
protein lainnya. Hal ini melatarbelakangi lahirnya pendekatan "baru" 
dalam PE yaitu random mutation. Ada dua metoda utama dalam teknik 
ini yaitu DNA shuffling dan error-prone PCR.

DNA shuffling pertama dikembangkan oleh Willem P.C. Stemmer dari 
Affymax Research Institute di California pada tahun 1994 (13). Dalam 
metoda ini, (minimal) dua gen berbeda suatu protein dipotong secara 
random dengan nuclease kemudian dirangkaikan sambil diperbanyak menggunakan 
PCR (Gambar 3). Dalam proses perangkaian tadi, secara random DNA 
polymerase akan menggabungkan fragmen DNA yang ada sehingga terjadi 
proses mutasi pada gen secara keseluruhan. Menggunakan metode ini 
beberapa protein telah berhasil dimutasi secara efisien untuk memiliki 
sifat yang diharapkan (14,15). Dari pengalaman penulis, proses perangkaian 
fragmen DNA melalui PCR tadi tampaknya memerlukan know-how yang sulit 
didapat hanya dari yang tertulis di paper saja. Sehingga penggunaan 
metode ini oleh grup peneliti lain, relatif jarang.

@

G

ambar 3. Gambar skema contoh proses dalam DNA shuffling

Metode kedua yang menggunakan fenomena kesalahan pembacaan DNA dalam 
proses amplifikasi PCR (error-prone PCR) lebih mudah dipraktikkan 
dan akhir-akhir ini mendapat perhatian besar atas keberhasilan yang 
menonjol dari grup Caltech yang dipimpin oleh seorang Professor wanita,
Frances H. Arnold. Fenomena error-prone PCR sudah dikenal sejak 
tahun 1985 dan pada tahun 1989, protokol standarnya telah dikembangkan 
(16). Pada prinsipnya, dengan menggantikan Mg2+ dengan Mn2+ serta 
meninggikan konsentrasi dATP dibanding dNTP yang lain, akan menghasilkan 
produk PCR dengan frekuensi kesalahan yang jauh lebih besar. Kunci 
keberhasilan PE dengan metoda ini adalah pada tahapan screening produk 
gen tersebut. Menemukan kondisi screening yang efektif, misalnya 
screening yang dapat dilakukan secara in-vivo di atas plate, sangat 
berpengaruh dalam efisiensi PE ini. Grup Arnold telah berhasil mengembangkan 
protein dengan berbagai karakter yang unik menggunakan metoda ini 
(17 dan referensi yang ada di dalamnya). Kombinasi dari DNA shuffling 
dan error-prone PCR juga telah dicoba untuk mendapatkan tingkat mutasi 
yang lebih tinggi (18). Teknik mutasi secara random yang diikuti 
dengan screening dan dilakukan berulang kali ini, mirip proses evolusi 
dimana suatu sifat yang paling sesuai dengan lingkungan (adaptasi) 
bakal bertahan, sehingga teknik ini sering pula disebut directed 
evolution.

Aplikasi komputer dalam biologi, yang dikenal dengan bidang bioinformatika,
akan semakin penting (19). Desain protein sampai ukuran 100-an asam 
amino mulai dapat dilakukan menggunakan bantuan komputer (20). Namun 
masih banyak kendala, seperti struktur yang kurang stabil dan sebagainya,
apalagi untuk protein berukuran lebih besar. Kombinasi dengan random 
mutation telah berhasil menghasilkan protein baru dengan fungsi tertentu 
(21).

5. PE Glucose dehydrogenase sebagai contoh komersialisasi protein

Tidak sedikit, PE dilakukan terhadap satu sifat protein seperti stabilitas,
aktivitas, spesifikasi substrat dan sebagainya. Di lapangan, komersialisasi 
sebuah produk protein memerlukan tahapan yang komplek dimana PE secara 
"komplit" terhadap berbagai karakter protein, diperlukan. Untuk memberikan 
gambaran, berikut ini diuraikan PE enzim glucose dehydrogenase untuk 
digunakan sebagai komponen dalam sensor glukosa.

Biosensor menggunakan komponen biologis seperti protein (prosentase 
terbesar), sel sampai kepada jaringan/organ. Biosensor kebanyakan 
digunakan untuk keperluan diagnostik kondisi pasien dan pasar dunia 
biosensor (lebih dari 500 juta USD) yang utama (lebih dari 90 %),
dipegang oleh biosensor glukosa untuk mengukur kadar gula penderita 
diabetes. Enzim yang digunakan untuk sensor glukosa saat ini adalah 
glucose oxidase (GOD) dari mold seperti Penicillium sp., Aspergillus 
sp. dan lain-lain. Berkat perkembangan sirkuit elektronik, kimia 
bahan, dan lain-lain dari biosensor yang bersifat multidisipliner 
tersebut, sensor glukosa dapat dibeli dengan harga terjangkau dan 
mudah pakai (22). Akan tetapi komponen pengenalnya, enzim GOD sama 
sekali tidak mengalami perbaikan sejak pertama kali digunakan 40 
tahun yang lalu. Enzim GOD tetap dipergunakan antara lain karena 
mudah didapatkan serta stabil. Tetapi kelemahan utamanya, dalam reaksinya 
mengoksidasi glukosa, bergantung pada konsentrasi oksigen dalam sampel 
di mana kadarnya tentu sangat bervariasi. Saat ini, hal itu ditanggulangi 
dengan menggunakan mediator (lazimnya, ferricyan ion). Untuk itulah,
diperlukan satu enzim baru yang tidak bergantung pada kadar oksigen.


Pilihan jatuh pada enzim glucose dehydrogenase (GDH) yang tidak hanya 
independent terhadap kadar oksigen, juga memiliki aktivitas yang 
tinggi. Ada dua jenis GDH, yaitu tipe membrane-bound (m-GDH, kadang 
disebut pula GDH-A) yang ditemukan pada banyak Gram-negative bacteria 
seperti Escherichia coli, Acinetobacter calcoaceticus dan sebagainya,
serta tipe soluble (s-GDH, kadang disebut pula GDH-B) yang hanya 
ditemukan pada A. calcoaceticus. Tidak seperti GOD, kedua GDH hanya 
diproduksi oleh bakteri yang bersangkutan dalam jumlah kecil. Untuk 
itu, diperlukan pengembangan sistem produksi massal yang efisien 
serta low-cost. Menggunakan beberapa host-bacteria, produksi massal 
GDH telah berhasil dicapai (23, 24 m-GDH, 25 s-GDH). PE terhadap 
GDH dilakukan pula untuk meningkatkan karakter stabilitas (26, 27,
28 m-GDH, 29 s-GDH), spesifikasi substratnya (28 m-GDH, 30 s-GDH) 
dan range konsentrasi glukosa yang dapat diukur (31, 32 m-GDH). Selain 
itu, juga diadakan analisa stabilitas GDH dalam penyimpanan (33 m-
GDH). Barulah, GDH ini dapat dimanfaatkan secara komersial untuk 
sensor glukosa (22).

6. Prospek PE di Indonesia

Indonesia, sebagaimana diketahui, memiliki kekayaan biodiversitas 
dan sumber daya alam yang melimpah. Selain itu, dengan populasi yang 
besar, pasar industri bioteknologi di Indonesia sangat potensial.
Bioteknologi sudah cukup lama dikembangkan di Indonesia, namun sebagai 
sebuah industri belum mendapatkan porsi perhatian yang memadai, walau 
sebenarnya beberapa sektor industri yang ada, punya peluang yang 
menjanjikan (34). Extremophiles, adalah mikroba yang hidup dalam 
lingkungan ekstrem seperti panas yang tinggi, lingkungan bersifat 
alkali dan sebagainya. Dari mikroba seperti ini, banyak didapatkan 
protein yang bermanfaat untuk keperluan industri (35). Untuk itu 
tidak segan-segan, peneliti Eropa/Amerika maupun Jepang menjelajah 
negara-negara yang kaya biodiversitas, termasuk Indonesia (36). Lingkungan 
seperti itu sangat banyak berada di Indonesia baik di daratan bahkan 
di lautan. Untuk itu, Indonesia perlu melengkapi diri dengan koleksi 
mikroba yang lengkap dan terjaga dengan baik serta accessible untuk 
seluruh peneliti.

Apabila dana menjadi salah satu kendala dalam pengembangan PE secara 
khusus maupun bioteknologi secara umum di Indonesia, perlu siasat 
untuk menggunakan instrumen maupun teknologi alternatif. Penulis 
telah menggunakan program untuk protein modeling dalam LINUX (37) 
dan membandingkannya dengan program komersial serupa (38). Penulis 
juga telah berhasil mendapatkan expression vector untuk produksi 
massal rekombinan protein yang memerlukan inducer, IPTG yang lebih 
sedikit (25). Selain itu, perlu komunikasi yang intens antara peneliti 
bioteknologi Indonesia untuk tukar-menukar informasi maupun menjalin 
hubungan non-formal yang penting untuk kolaborasi mendatang. Hal 
ini antara lain telah coba diwadahi dengan media mailing list biotek@egroups.
com yang terbuka untuk praktisi maupun peminat bioteknologi. Dengan 
demikian, penulis beranggapan Indonesia memiliki prospek yang cukup 
bagus untuk pengembangan PE bagi industri, bila hal-hal di atas diperhatikan.


Catatan: Penelitian dalam tulisan ini dilakukan Protein Chemistry 
Laboratory (Professor Koji Sode), Department of Biotechnology, Tokyo 
University of Agriculture and Technology, Japan. Sebagian dari isi 
tulisan ini telah dipresentasikan dalam Seminar terbuka Hokuriku 
Science Forum (HSF) di Fukui University, 17 Desember 2000 (http://www.
jaist.ac.jp/~witarto/HSF).

Referensi

1. Radzicka, A. and Wolfenden, R. 1995. A Proficient Enzyme. Science 
267:90-93. 
2. Ulmer, K.M. 1983. Protein Engineering. Science 219: 666-671. 
3. Bott, R. and Boelens R. 1999. The role of high-resolution structural 
studies in the development of commercial enzymes. Current Opinion 
in Biotechnology 10: 391-397. 
4. Van den Burg, B. et al. 1998. Engineering an enzyme to resist 
boiling. Proc.Natl.Acad.Sci USA 95: 2056-2060. 
5. Malakauskas, S. and Mayo, S.L. 1998. Design, structure and stability 
of a hyperthermophilic protein variant. Nature Structure Biology 
5: 470-475. 
6. Witarto, A.B. and Sode, K. (in press). Increasing the hydrophobic 
interaction between terminals W-motifs enhances the stability of 
Salmonella typhimurium sialidase: A general strategy for the stabilization 
of beta-propeller fold. 
7. Witarto, A.B. 2000. Study on the conformational stability of ?-
propeller proteins. PhD thesis Tokyo University of Agriculture and 
Technology. 
8. Gibbs, C.S. et al. 1995. Conversion of thrombin into an anticoagulant 
by protein engineering. Nature 378: 413-416. 
9. Quemeneur, E. et al. 1998. Engineering cyclophilin into a proline-
specific endopeptidase. Nature 391: 301-303. 
10. Zhou, H.X., Wong, K.Y. and Vijayakumar, M. 1997. Design of fast 
enzymes by optimizing interaction potential in active site. Proc.
Natl.Acad.Sci USA 94: 12372-12377. 
11. Gulich, S. et al. 2000. Stability towards alkaline conditions 
can be engineered into a protein ligand. Journal of Biotechnology 
80: 169-178. 
12. http://www.research.ibm.com/bluegene/ 
13. Stemmer, W.P.C. 1994. Rapid evolution of a protein in vitro by 
DNA shuffling. Nature 370: 389-391. 
14. Crameri, A. et al. 1996. Improved Green Fluorescent Protein by 
Molecular Evolution Using DNA Shuffling. Nature Biotechnology 14:
315-319. 
15. Christians, F.C. et al. 1999. Directed evolution of thymidine 
kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling. Nature 
Biotechnology 17: 259-264. 
16. Leung, D.W., Chen, E. and Goeddel, D.V. 1989. A method for random 
mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polymerase 
chain reaction. Technique 1: 11-15. 
17. Arnold F.H. 1998. Design by Directed Evolution. Accounts of Chemical 
Research 31: 125-131. 
18. Ostermeier, M., Shim, J.H. and Benkovic, S.J. 1999. A combinatorial 
approach to hybrid enzymes independent of DNA homology. Nature Biotechnology 
17: 1205-1209. 
19. Witarto, A.B. 2001. Aplikasi komputasi dalam biologi. Paper dipersiapkan 
untuk Seminar IECI-Japan, The University of Tokyo. 
20. Dahiyat, B.I. and Mayo, S.L. 1997. De novo design protein design:
Fully automated sequence selection. Science 278: 82-87. 
21. Altamirano, M.M. et al. 2000. Directed evolution of new catalytic 
activity using the ?/?-barrel scaffold. Nature 403: 617-622. 
22. Witarto, A.B. 2000. From bench to business: The story of glucose 
sensor. Proc.Temu Ilmiah PPI-Jepang ke-9, pp.5-8. 
23. Sode, K. et al. 1994. Over expression of PQQ glucose dehydrogenase 
in Escherichia coli under holo enzyme forming conditioin. Biotechnology 
Letters 16: 1265-1268. 
24. Sode, K. et al. 1996. Increased production of recombinant pyrroloquinolie 
quinone (PQQ) glucose dehydrogenase by metabolically engineered Escherichia 
coli strain capable of PQQ biosynthesis. Journal of Biotechnology 
49: 239-243. 
25. Kojima, K., Witarto, A.B. and Sode, K. 2000. The production of 
soluble pyrroloquinoline quinone glucose dehydrogenase by Klebsiella 
pneumoniae, the alternative host of PQQ enzymes. Biotechnology Letters 
22: 1343-1347. 
26. Sode, K. et al. 1995. Thermostable PQQ glucose dehydrogenase.
FEBS Letters 364: 325-327. 
27. Witarto, A.B. Ohtera, T. and Sode, K. 1999. Site-directed mutagenesis 
study on the thermal stability of a chimeric PQQ glucose dehydrogenase 
and its structural interpretation. Applied Biochemistry and Biotechnology 
77-79: 159-168. 
28. Yoshida, H., Kojima, K., Witarto, A.B. and Sode, K. 1999. Engineering 
a chimeric pyrroloquinoline quinone glucose dehydrogenase: improvement 
of EDTA tolerance, thermal stability and substrate specificity. Protein 
Engineering 12: 63-70. 
29. Sode, K. et al. 2000. Increasing the thermal stability of the 
water-soluble pyrroloquinoline quinone glucose dehydrogenase by single 
amino acid replacement. Enzyme and Microbial Technology 26: 491-496.

30. Igarashi, S. et al. 2000. Construction and characterization of 
mutant water-soluble PQQ glucose dehydrogenases with altered Km values 
- site-directed mutagenesis studies on the putative active site. 
Biochemical and Biophysical Research Communications 264: 820-824.

31. Sode, K. and Kojima, K. 1997. Improved substrate specificity 
and dynamic range for glucose measurement of Escherichia coli PQQ 
glucose dehydrogenase by site directed mutagenesis. Biotechnology 
Letters 19: 1073-1077. 
32. Yamazaki, T., Kojima, K. and Sode, K. 2000. Extended-range glucose 
sensor employing engineered glucose dehydrogenases.Analytical Chemistry 
72: 4689-4693. 
33. Sode, K. and Yasutake, N. 1997. Preparation of lyophilized pyrroloquinoline 
quinone glucose dehydrogenase using trehalose as an additive. Biotechnology 
Techniques 11: 577-580. 
34. Witarto, A.B. 2001. Current state of Indonesia Bioindustry and 
its prospect in global market era. Paper prepared for IASA Symposium 
on Agri-Bioche, The University of Tokyo. 
35. Hough, D.W. and Danson, M.J. 1999. Extremozymes. Current Opinion 
in Chemical Biology 3: 39-46. 
36. Pengakuan beberapa peneliti dalam International Conggress on 
Extremophiles. 18-22 January 1998, The Pacific Yokohama Conference 
Center, Japan. 
37. Witarto, A.B. 1997. Protein Engineering of PQQ Rekayasa protein 
enzim PQQ glucose dehydrogenase untuk komponen biosensor glukosa.
Inovasi 7: 20-28. 
38. Witarto, A.B. et al. 1999. Secondary structure study of pyrroloquinoline 
quinone glucose dehydrogenase. Journal of Biochemistry, Molecular 
Biology and Biophysics 2: 209-213. 






Reply via email to